Главная / Helixbook / Исследование состава микробиоты толстого кишечника у детей. ЭНТЕРОФЛОР [реал-тайм ПЦР] /
09-205

Исследование состава микробиоты толстого кишечника у детей. ЭНТЕРОФЛОР [реал-тайм ПЦР]

Исследование состава микробиоты толстого кишечника у детей 0-14 лет. Новая технология диагностики состава микробиоты толстого кишечника, разработанная компанией "ДНК-Технология" совместно с врачами-экспертами. Исследование "Энтерофлор® Дети" предназначено для определения ДНК кишечно-ассоциированных микроорганизмов (отделы Bacillota (Firmicutes), Pseudomonadota (Proteobacteria), Bacteroidota (Bacteroidetes), Actinomycetota (Actinobacteria), Fusobacteriota (Fusobacteria), Verrucomicrobiota (Verrucomicrobia), Euryarchaeota), в том числе грибов рода Candida, а также гена метициллинрезистентности Staphylococcus spp. (mecA), Cl. difficile с генами энтеротоксинов А и В (tcdA, tcdB), Str. agalactiae с геном инвазивности (srr2) методом ПЦР в режиме реального времени в препаратах ДНК, полученных из образцов кала детей, в целях оценки состава микробиоты толстого кишечника. Исследование рекомендуется при необходимости определения качественного состава и количественной оценки микробиоты толстого кишечника в ходе проведения лечебно-диагностических мероприятий.

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Кал.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исследование рекомендуется проводить до начала приема антибиотиков и других антибактериальных химиотерапевтических препаратов.

Общая информация об исследовании

Микробиота кишечника человека представляет собой сложную, динамичную экосистему, населенную множеством микроорганизмов, включая бактерии, грибы, археи и вирусы. Они взаимодействуют между собой и с организмом человека, участвуя во множестве метаболических процессов. Общее количество микробных клеток в кишечнике человека может на порядок превышать число собственных клеток организма. Совокупное число белоккодирующих генов микробиоты в сотни раз больше количества человеческих генов. Это позволяет кишечному микробиому выполнять ряд функций, которые недоступны клеткам организма человека.

Микробиота кишечника участвует в метаболизме углеводов и белков, обмене жиров, а также производит такие важные промежуточные продукты обмена веществ, как короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК), вторичные желчные кислоты (ВЖК), витамины и липополисахариды. Эти метаболиты выполняют роль сигнальных молекул, участвующих в работе всех систем организма человека, в том числе влияют на аппетит, перистальтику кишечника, потребление и накопление энергии. Микробиота стимулирует созревание иммунной системы и участвует в обеспечении барьерной функции кишечника, защищая его от колонизации патогенами.

На видовом уровне сложно выделить филогенетическое "ядро микробиоты" – доминирующие микроорганизмы, встречающиеся у большинства людей (> 50 %). Это связано с функциональной избыточностью микробиоты: ряд функций может выполняться представителями разных таксонов. Кроме того, метаболические функции микроорганизмов могут быть гомогенны даже внутри семейства, то есть разные виды могут
функционально замещать друг друга и преобладать в микробиоте разных здоровых людей без нарушения биоценоза.

Детский возраст – период формирования микробиома кишечника. Вопрос о наличии и происхождении "микробиоты" мекония является спорным. В кишечнике плода в норме микробиоты нет, поскольку отсутствуют субстраты для питания микроорганизмов. Источниками появления микробиоты в меконии новорождённого могут быть как вагинальная, кожная и фекальная микробиота матери, так и наружная поверхность ворсин хориона. В любом случае до начала вскармливания ребенка микробиота мекония является транзиторной. Формирование собственной кишечной микробиоты ребенка – это длительный и динамичный процесс. Динамика формирования кишечной микробиоты у детей зависит от срока гестации, способа родоразрешения, типа питания и применения антибиотиков, поэтому состав микробиоты может различаться у детей одного возраста.

Кишечная микробиота младенцев, рожденных естественным путемхарактеризуется низким разнообразием, но стабильным составом, так как при родах дети контактируют с представителями вагинальной, кожной и фекальной микробиоты матери. У детей, рожденных путем кесарева сечения, формирование кишечной микробиоты происходит дольше и чаще обнаруживаются условно-патогенные микроорганизмы (УПМ), такие как Clostridium difficile, Enterococcus spp., Klebsiella spp., Streptococcus spp. и Veillonella spp.

При грудном вскармливании микробиота кишечника представлена в основном Bifidobacterium spp. (в частности Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum), а также Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp. и Lactococcus spp. У детей, находящихся на искусственном вскармливании, в микробиоте преобладают анаэробы – представители родов Bacteroides и Clostridium – и снижено число бифидобактерий.

Гестационный возраст является еще одним ключевым фактором, влияющим на формирование микробиоты кишечника. У недоношенных детей развитие пищеварительной и иммунной систем не завершено. Госпитализация, искусственное вскармливание, применение антибиотиков
могут привести к необратимым изменениям в естественном процессе колонизации и развития микробиоты кишечника. В частности, у недоношенных новорождённых задерживается анаэробная колонизация и их фекалии содержат большие количества
Enterobacteriaceae, Enterococcus и УПМ по сравнению с доношенными новорождёнными.

Применение антибиотиков уменьшает общее разнообразие микробиоты, приводит к увеличению содержания резистентных и потенциально
патогенных
Enterobacteriaceae и Clostridium при снижении количества Bifidobacteriaceae, Bacilli и Lactobacillales.

Нормальная микробиота представлена широким спектром микроорганизмов, которые в основном являются представителями трех филумов: Bacillota (Firmicutes), Bacteroidota (Bacteroidetes), Actinomycetota (Actinobacteria).

Филум Actinomycetota (Actinobacteria) в кишечной микробиоте детей представлен родом Bifidobacterium и классом Coriobacteriia. Бифидобактерии в числе первых заселяют кишечник ребенка после рождения и на первых месяцах жизни являются доминирующей группой кишечной микробиоты. С возрастом микробиота становится более разнообразной по составу, но бифидобактерии по-прежнему играют свою важную роль в поддержании здоровья человека. Они предотвращают проникновение возбудителей кишечных инфекций, препятствуя колонизации кишечника патогенами.

Большая часть кишечных микроорганизмов филума Bacillota (Firmicutes) относится к классу Clostridia. Это наиболее представленный таксон в кишечнике человека, участники которого могут как входить в нормальную микробиоту, так и относиться к условно-патогенной или даже патогенной микробиоте. Клостридии нормобиоты расщепляют белки и жиры, поставляя пищевые субстраты другим микроорганизмам. Они производят бутират (КЖК) – основной источник энергии для эпителиоцитов толстой кишки. Внутри рода Clostridium наиболее представлены в нормобиоте кишечника Clostridium leptum gr. и Lachnospiraceae (Clostridium coccoides gr), составляющие до 40 и 35 % соответственно от общего количества бактерий.

Филум Bacteroidota (Bacteroidetes) является вторым по объему в кишечной микробиоте. Представители филума Bacteroidota (Bacteroidetes) играют важную роль в метаболизме полисахаридов, являются основными производителями противовоспалительных КЖК в кишечнике и секретируют метаболиты, участвующие в регуляции работы иммунной и нервной систем.

Таким образом, большая часть микробиоты у детей после двух лет представлена именно бактериями филума Bacillota (Firmicutes). Их снижение и сдвиг соотношения Bacillota (Firmicutes) / Bacteroidota (Bacteroidetes) в сторону Bacteroidota (Bacteroidetes) могут быть связаны с развитием воспалительного процесса. Язвенный колит и болезнь Крона часто связаны со значительным увеличением представителей Bacteroides и Prevotella, изменением количества бифидобактерий и уменьшением фирмикутов C. leptum gr, особенно F. prausnitzii [37-38]. При целиакии наблюдается снижение представителей Lactobacillus и Bifidobacteria и возрастание уровня провоспалительных бактерий, включая семейство Veillonellaceae.

Стандартным методом исследования состава микробиоты человека является культуральный метод. Однако 50-80 % микроорганизмов, составляющих кишечную микробиоту, являются труднокультивируемыми и не выявляются микробиологическим методом, кроме того, результаты посева напрямую зависят от сохранения жизнеспособности микроорганизмов. Посев кала на дисбактериоз предполагает выявление определенного спектра бактерий и грибов в отличие от стандартного посева, при котором происходит культивирование широкого перечня микроорганизмов на различных питательных средах. В то же время исследование на дисбактериоз имеет ограничения, свойственные микробиологическому анализу в целом.

В настоящее время наиболее оптимальный подход для исследования микробиоты – применение ПЦР в реальном времени. Это точное и быстрое количественное определение микроорганизмов в образце с использованием видоспецифичных или группоспецифичных праймеров и последующей нормализацией полученных результатов на количество копий генов-мишеней. Многопробирочный и мультиплексный формат исследования позволяет сочетать выявление крупных таксонов с детекцией нескольких ключевых видов и/или субпопуляций микробиоты.

В набор реагентов "Энтерофлор® Дети" входят таксоны, составляющие не менее 99,9 % суммарной прокариотической массы фекалий ребенка. Согласно опубликованным данным, были выделены функциональные таксономические группы, объединенные по основным метаболическим характеристикам и воздействию на организм хозяина. Таким образом, выявляемые в наборе реагентов "Энтерофлор® Дети" таксоны детализированы до уровня клинической значимости с учетом возраста ребенка.

Когда назначается исследование?

  • При необходимости определения качественного состава и количественной оценки микробиоты толстого кишечника в ходе проведения лечебно-диагностических мероприятий.
  • Длительно протекающие кишечные расстройства, при которых не удается выделить патогенные микроорганизмы.
  • Дисфункция кишечника у детей при интенсивной антибиотико- и/или иммуносупрессивной терапии, длительной химиотерапии, гормональной терапии.
  • Затянувшийся период восстановления после дизентерии и других острых кишечных инфекционных заболеваний.
  • Предоперационный период у лиц с факторами риска развития дисбактериоза кишечника.
  • Аллергические заболевания (атопический дерматит, бронхиальная астма и пр.), трудно поддающиеся лечению.
  • Внутриутробная инфекция.
  • Раннее искусственное вскармливание.
  • Непереносимость грудного молока.
  • Иммунодефицитные состояния.
  • Частые острые респираторные инфекции.
  • Задержка нарастания или снижение массы тела, отставание в физическом развитии.
  • Стоматит, молочница.
  • Контроль формирования кишечной микробиоты у детей первого года жизни.

Что означают результаты?

Определение состояния микробиоты кишечника с учетом долей нормобиоты и условно-патогенной микробиоты в общем количестве бактерий
(ОБМ):
количественная оценка представителей нормобиоты (филумы Actinomycetota (Actinobacteria), Bacillota (Firmicutes), Bacteroidota (Bacteroidetes), Pseudomonadota (Proteobacteria), условно-патогенной микробиоты и грибов рода Candida;
оценка разнообразия нормальной микробиоты;
определение количества бифидо- и лактобактерий;
определение видов бифидобактерий;
расчет соотношения Bacillota (Firmicutes), Bacteroidota (Bacteroidetes);
оценка присутствия представителей таксона Bacteroidetes;
определение факторов патогенности и резистентности: mecA, srr2, tcdA, tcdB.

Краткий отчет формируется с учетом возраста ребенка на основании сравнения соотношений разных микроорганизмов / групп микроорганизмов как между собой, так и с общим количеством бактерий с учетом возраста ребенка. Заключение формируется с учётом возрастных норм состава микробиоты кишечника детей.

Состояние нормобиоза отражает динамичное равновесие между компонентами микробиоты (с преобладанием представителей нормобиоты). Возможные отклонения от нормы отдельных представителей нормобиоты в ту или иную сторону могут взаимно компенсироваться. Это связано с функциональной избыточностью микробиоты: ряд функций может выполняться представителями разных групп микроорганизмов. Например, в утилизации крахмала могут принимать участие как бифидобактерии, так и некоторые бактероиды.

Трактовать результаты выявления маркеров патогенности и резистентности в количестве, превышающем пороговое значение, следует с учётом клинической картины у конкретного пациента, особенно в случаях нарушения нормобиоза кишечника.

Streptococcus agalactiae не представляет угрозы здоровью ребёнка, однако способность этого стрептококка к проникновению в клетки человека и потенциально индукции энцефалита у новорождённых ассоциирована с наличием маркера инвазивности srr2.

Стафилококки, в том числе и метициллинрезистентные (mecA+) штаммы, в количестве, не превышающем порогового значения, часто являются нормальными компонентами кишечного микробиома. При дисбиозе заселение кишечника антибиотикоустойчивыми микроорганизмами становится более вероятным. В этом случае возможная неизбирательная антибиотикотерапия по любому другому поводу может привести к появлению мультирезистентного штамма стафилококка, увеличению его количества, снижению барьерной функции кишечной микробиоты, приводящей, например, к таким осложнениям, как сепсис.

Носительство токсигенного и нетоксигенного штамма C. difficile для детей возрастом до 2 лет является вариантом нормы и не представляет угрозы здоровью ребёнка, предположительно, благодаря отсутствию рецепторов для токсина у детских энтероцитов. По мере созревания иммунной системы ребёнка C. difficile в норме вытесняется из состава кишечной микробиоты примерно к 2 годам жизни. У детей старшего возраста в норме токсигенный штамм C. difficile присутствовать не должен.

В норме филум Bacillota (Firmicutes), куда входит огромное количество бактерий, в том числе составляющих нормобиоту человека, преобладает над филумом Bacteroidota (Bacteroidetes). Но соотношение Bacillota (Firmicutes) / Bacteroidota (Bacteroidetes) снижается при воспалительных заболеваниях кишечника, таких как язвенный колит, болезнь Крона и других.

Определение маркеров воспаления кишечника в исследовании не предусмотрено, но снижение coотношения Bacillota (Firmicutes) / Bacteroidota (Bacteroidetes) косвенно свидетельствует о наличии хронического воспалительного процесса в кишечнике.

Результат исследования "ЭНТЕРОФЛОР® Дети" выражен десятичным логарифмом количества геном-эквивалентов каждой группы или отдельных микроорганизмов в 1 грамме кала. Например, значение 9,3 Lg(ГЭ/г) – это 10^9,3 ГЭ/г. Результат микробиологического исследования традиционно выражен в КОЕ/г, например, 10^8 КОЕ/г.

Важные замечания

  • Микробиота кишечника человека представляет собой сложную, динамичную систему, состоящую из множества групп микроорганизмов, которые взаимодействуют между собой и с организмом человека, выполняя ряд важных функций. Наиболее корректно оценивать микробиоту кишечника, рассматривая все группы микроорганизмов как компоненты одного целого. В исследование "ЭНТЕРОФЛОР® Дети" входят 43 показателя, соответствующие не менее 99,9 % микробиоты кишечника детей.
  • Тест "ЭНТЕРОФЛОР® Дети" предназначен для диагностики дисбиотических нарушений кишечника, связанных с хроническими воспалительными процессами, длительными нарушениями пищеварения, приемом антибиотиков и т.д. При наличии у пациента симптомов ОКИ (рвота, диарея, боли в животе) в случаях, если возбудители острой кишечной инфекции обнаружены не были, можно назначить исследование "ЭНТЕРОФЛОР® Дети".
  • Алгоритм для формирования заключения разработан для детей до 14 лет. При исследовании образцов биоматериала пациентов более старшего возраста итоговая оценка состояния микробиоты кишечника может быть затруднена.
  • В основе микробиологического анализа кала на дисбактериоз и исследования методом ПЦР лежат две разных технологии, поэтому результаты могут различаться.

Литература

ЭНТЕРОФЛОР® Дети. © OOO "ДНК-Технология", 2024 г.

Cтоимость:
4500 ₽
Взятие биоматериала:
от
0 ₽
Санкт-Петербург