Исследование состава микробиоты толстого кишечника у детей. ЭНТЕРОФЛОР [реал-тайм ПЦР]

Исследование состава микробиоты толстого кишечника у детей 0-14 лет. Новая технология диагностики состава микробиоты толстого кишечника, разработанная компанией "ДНК-Технология" совместно с врачами-экспертами. Исследование "Энтерофлор® Дети" предназначено для определения ДНК кишечно-ассоциированных микроорганизмов (отделы Bacillota (Firmicutes), Pseudomonadota (Proteobacteria), Bacteroidota (Bacteroidetes), Actinomycetota (Actinobacteria), Fusobacteriota (Fusobacteria), Verrucomicrobiota (Verrucomicrobia), Euryarchaeota), в том числе грибов рода Candida, а также гена метициллинрезистентности Staphylococcus spp. (mecA), Cl. difficile с генами энтеротоксинов А и В (tcdA, tcdB), Str. agalactiae с геном инвазивности (srr2) методом ПЦР в режиме реального времени в препаратах ДНК, полученных из образцов кала детей, в целях оценки состава микробиоты толстого кишечника. Исследование рекомендуется при необходимости определения качественного состава и количественной оценки микробиоты толстого кишечника в ходе проведения лечебно-диагностических мероприятий.

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Кал.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исследование рекомендуется проводить до начала приема антибиотиков и других антибактериальных химиотерапевтических препаратов.

Общая информация об исследовании

Микробиота кишечника человека представляет собой сложную, динамичную экосистему, населенную множеством микроорганизмов, включая бактерии, грибы, археи и вирусы. Они взаимодействуют между собой и с организмом человека, участвуя во множестве метаболических процессов. Общее количество микробных клеток в кишечнике человека может на порядок превышать число собственных клеток организма. Совокупное число белоккодирующих генов микробиоты в сотни раз больше количества человеческих генов. Это позволяет кишечному микробиому выполнять ряд функций, которые недоступны клеткам организма человека.

Микробиота кишечника участвует в метаболизме углеводов и белков, обмене жиров, а также производит такие важные промежуточные продукты обмена веществ, как короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК), вторичные желчные кислоты (ВЖК), витамины и липополисахариды. Эти метаболиты выполняют роль сигнальных молекул, участвующих в работе всех систем организма человека, в том числе влияют на аппетит, перистальтику кишечника, потребление и накопление энергии. Микробиота стимулирует созревание иммунной системы и участвует в обеспечении барьерной функции кишечника, защищая его от колонизации патогенами.

На видовом уровне сложно выделить филогенетическое "ядро микробиоты" – доминирующие микроорганизмы, встречающиеся у большинства людей (> 50 %). Это связано с функциональной избыточностью микробиоты: ряд функций может выполняться представителями разных таксонов. Кроме того, метаболические функции микроорганизмов могут быть гомогенны даже внутри семейства, то есть разные виды могут
функционально замещать друг друга и преобладать в микробиоте разных здоровых людей без нарушения биоценоза.

Детский возраст – период формирования микробиома кишечника. Вопрос о наличии и происхождении "микробиоты" мекония является спорным. В кишечнике плода в норме микробиоты нет, поскольку отсутствуют субстраты для питания микроорганизмов. Источниками появления микробиоты в меконии новорождённого могут быть как вагинальная, кожная и фекальная микробиота матери, так и наружная поверхность ворсин хориона. В любом случае до начала вскармливания ребенка микробиота мекония является транзиторной. Формирование собственной кишечной микробиоты ребенка – это длительный и динамичный процесс. Динамика формирования кишечной микробиоты у детей зависит от срока гестации, способа родоразрешения, типа питания и применения антибиотиков, поэтому состав микробиоты может различаться у детей одного возраста.

Кишечная микробиота младенцев, рожденных естественным путем, характеризуется низким разнообразием, но стабильным составом, так как при родах дети контактируют с представителями вагинальной, кожной и фекальной микробиоты матери. У детей, рожденных путем кесарева сечения, формирование кишечной микробиоты происходит дольше и чаще обнаруживаются условно-патогенные микроорганизмы (УПМ), такие как Clostridium difficile, Enterococcus spp., Klebsiella spp., Streptococcus spp. и Veillonella spp.

При грудном вскармливании микробиота кишечника представлена в основном Bifidobacterium spp. (в частности Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum), а также Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp. и Lactococcus spp. У детей, находящихся на искусственном вскармливании, в микробиоте преобладают анаэробы – представители родов Bacteroides и Clostridium – и снижено число бифидобактерий.

Гестационный возраст является еще одним ключевым фактором, влияющим на формирование микробиоты кишечника. У недоношенных детей развитие пищеварительной и иммунной систем не завершено. Госпитализация, искусственное вскармливание, применение антибиотиков
могут привести к необратимым изменениям в естественном процессе колонизации и развития микробиоты кишечника. В частности, у недоношенных новорождённых задерживается анаэробная колонизация и их фекалии содержат большие количества Enterobacteriaceae, Enterococcus и УПМ по сравнению с доношенными новорождёнными.

Применение антибиотиков уменьшает общее разнообразие микробиоты, приводит к увеличению содержания резистентных и потенциально
патогенных Enterobacteriaceae и Clostridium при снижении количества Bifidobacteriaceae, Bacilli и Lactobacillales.

Нормальная микробиота представлена широким спектром микроорганизмов, которые в основном являются представителями трех филумов: Bacillota (Firmicutes), Bacteroidota (Bacteroidetes), Actinomycetota (Actinobacteria).

Филум Actinomycetota (Actinobacteria) в кишечной микробиоте детей представлен родом Bifidobacterium и классом Coriobacteriia. Бифидобактерии в числе первых заселяют кишечник ребенка после рождения и на первых месяцах жизни являются доминирующей группой кишечной микробиоты. С возрастом микробиота становится более разнообразной по составу, но бифидобактерии по-прежнему играют свою важную роль в поддержании здоровья человека. Они предотвращают проникновение возбудителей кишечных инфекций, препятствуя колонизации кишечника патогенами.

Большая часть кишечных микроорганизмов филума Bacillota (Firmicutes) относится к классу Clostridia. Это наиболее представленный таксон в кишечнике человека, участники которого могут как входить в нормальную микробиоту, так и относиться к условно-патогенной или даже патогенной микробиоте. Клостридии нормобиоты расщепляют белки и жиры, поставляя пищевые субстраты другим микроорганизмам. Они производят бутират (КЖК) – основной источник энергии для эпителиоцитов толстой кишки. Внутри рода Clostridium наиболее представлены в нормобиоте кишечника Clostridium leptum gr. и Lachnospiraceae (Clostridium coccoides gr), составляющие до 40 и 35 % соответственно от общего количества бактерий.

Филум Bacteroidota (Bacteroidetes) является вторым по объему в кишечной микробиоте. Представители филума Bacteroidota (Bacteroidetes) играют важную роль в метаболизме полисахаридов, являются основными производителями противовоспалительных КЖК в кишечнике и секретируют метаболиты, участвующие в регуляции работы иммунной и нервной систем.

Таким образом, большая часть микробиоты у детей после двух лет представлена именно бактериями филума Bacillota (Firmicutes). Их снижение и сдвиг соотношения Bacillota (Firmicutes) / Bacteroidota (Bacteroidetes) в сторону Bacteroidota (Bacteroidetes) могут быть связаны с развитием воспалительного процесса. Язвенный колит и болезнь Крона часто связаны со значительным увеличением представителей Bacteroides и Prevotella, изменением количества бифидобактерий и уменьшением фирмикутов C. leptum gr, особенно F. prausnitzii [37-38]. При целиакии наблюдается снижение представителей Lactobacillus и Bifidobacteria и возрастание уровня провоспалительных бактерий, включая семейство Veillonellaceae.

Стандартным методом исследования состава микробиоты человека является культуральный метод. Однако 50-80 % микроорганизмов, составляющих кишечную микробиоту, являются труднокультивируемыми и не выявляются микробиологическим методом, кроме того, результаты посева напрямую зависят от сохранения жизнеспособности микроорганизмов. Посев кала на дисбактериоз предполагает выявление определенного спектра бактерий и грибов в отличие от стандартного посева, при котором происходит культивирование широкого перечня микроорганизмов на различных питательных средах. В то же время исследование на дисбактериоз имеет ограничения, свойственные микробиологическому анализу в целом.

В настоящее время наиболее оптимальный подход для исследования микробиоты – применение ПЦР в реальном времени. Это точное и быстрое количественное определение микроорганизмов в образце с использованием видоспецифичных или группоспецифичных праймеров и последующей нормализацией полученных результатов на количество копий генов-мишеней. Многопробирочный и мультиплексный формат исследования позволяет сочетать выявление крупных таксонов с детекцией нескольких ключевых видов и/или субпопуляций микробиоты.

В набор реагентов "Энтерофлор® Дети" входят таксоны, составляющие не менее 99,9 % суммарной прокариотической массы фекалий ребенка. Согласно опубликованным данным, были выделены функциональные таксономические группы, объединенные по основным метаболическим характеристикам и воздействию на организм хозяина. Таким образом, выявляемые в наборе реагентов "Энтерофлор® Дети" таксоны детализированы до уровня клинической значимости с учетом возраста ребенка.

Когда назначается исследование?

• При необходимости определения качественного состава и количественной оценки микробиоты толстого кишечника в ходе проведения лечебно-диагностических мероприятий.
  
• Длительно протекающие кишечные расстройства, при которых не удается выделить патогенные микроорганизмы.
• Дисфункция кишечника у детей при интенсивной антибиотико- и/или иммуносупрессивной терапии, длительной химиотерапии, гормональной терапии.
• Затянувшийся период восстановления после дизентерии и других острых кишечных инфекционных заболеваний.
• Предоперационный период у лиц с факторами риска развития дисбактериоза кишечника.
• Аллергические заболевания (атопический дерматит, бронхиальная астма и пр.), трудно поддающиеся лечению.
• Внутриутробная инфекция.
• Раннее искусственное вскармливание.
• Непереносимость грудного молока.
• Иммунодефицитные состояния.
• Частые острые респираторные инфекции.
• Задержка нарастания или снижение массы тела, отставание в физическом развитии.
• Стоматит, молочница.
• Контроль формирования кишечной микробиоты у детей первого года жизни.

Что означают результаты?

Определение состояния микробиоты кишечника с учетом долей нормобиоты и условно-патогенной микробиоты в общем количестве бактерий
(ОБМ):
• количественная оценка представителей нормобиоты (филумы Actinomycetota (Actinobacteria), Bacillota (Firmicutes), Bacteroidota (Bacteroidetes), Pseudomonadota (Proteobacteria), условно-патогенной микробиоты и грибов рода Candida;
• оценка разнообразия нормальной микробиоты;
• определение количества бифидо- и лактобактерий;
• определение видов бифидобактерий;
• расчет соотношения Bacillota (Firmicutes), Bacteroidota (Bacteroidetes);
• оценка присутствия представителей таксона Bacteroidetes;
• определение факторов патогенности и резистентности: mecA, srr2, tcdA, tcdB.

Важные замечания

• Микробиота кишечника человека представляет собой сложную, динамичную систему, состоящую из множества групп микроорганизмов, которые взаимодействуют между собой и с организмом человека, выполняя ряд важных функций. Наиболее корректно оценивать микробиоту кишечника, рассматривая все группы микроорганизмов как компоненты одного целого. В исследование "ЭНТЕРОФЛОР® Дети" входят 43 показателя, соответствующие не менее 99,9 % микробиоты кишечника детей.
• Тест "ЭНТЕРОФЛОР® Дети" предназначен для диагностики дисбиотических нарушений кишечника, связанных с хроническими воспалительными процессами, длительными нарушениями пищеварения, приемом антибиотиков и т.д. При наличии у пациента симптомов ОКИ (рвота, диарея, боли в животе) в случаях, если возбудители острой кишечной инфекции обнаружены не были, можно назначить исследование "ЭНТЕРОФЛОР® Дети".
• Алгоритм для формирования заключения разработан для детей до 14 лет. При исследовании образцов биоматериала пациентов более старшего возраста итоговая оценка состояния микробиоты кишечника может быть затруднена.
• В основе микробиологического анализа кала на дисбактериоз и исследования методом ПЦР лежат две разных технологии, поэтому результаты могут различаться.

Литература

ЭНТЕРОФЛОР® Дети. © OOO "ДНК-Технология", 2024 г.