Хронический миелолейкоз. FISH анализ химерного гена BCR/ABL

Метод молекулярно-генетической диагностики хронического миелолейкоза, позволяющий выявить в генетическом материале клеток крови или костного мозга мутантный ген, продукт деятельности которого играет ключевую роль в развитии этого заболевания.

Синонимы русские

Исследование клеток крови методом FISH (t (9; 22)/BCR/ABL), FISH  анализ транслокации t(9;22)  BCR-ABL.

Синонимы английские

BCR/ABL1 Translocation (9;22), FISH; Philadelphia Chromosome, BCR-ABL1 Fusion.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Специальной подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Хронический миелолейкоз является опухолевым заболеванием кроветворной системы, в результате которого в периферической крови наблюдается повышение уровня определенного вида лейкоцитов. Развитие заболевания связано с возникновением в стволовой клетке крови генетической аномалии, которая получила название филадельфийской хромосомы. У человека на девятой хромосоме локализуется ген ABL, который кодирует образование белка, стимулирующего рост и деление клеток. При хроническом миелолейкозе часть гена ABL перемещается на хромосому 22, такая мутация называется транслокацией. Место разрыва двадцать второй хромосомы, куда чаще всего встраивается перемещенная часть гена ABL, называется M-bcr (от английского major breakpoint claster region). В норме в этом участке хромосомы расположен ген BCR, кодирующий белок, функция которого в настоящее время достоверно не изучена, однако есть сведения, что он участвует в процессах деления и дифференцировки клеток. В результате транслокации на 22-й хромосоме образуется сливной, или химерный, ген BCR-ABL, при считывании информации с которого продуцируется белок р210. От части гена ABL этот белок получает способности тирозинкиназы – внутриклеточного фермента, участвующего в передаче сигналов пролиферации, а часть, кодируемая геном BCR, способствует его активации. Таким образом, в результате описанной мутации на 22-й хромосоме формируется ген, белковый продукт которого – тирозинкиназа с повышенной активностью – активирует деление клеток с полной независимостью от внешних регуляторных механизмов. Лейкозные клетки становятся нечувствительными к сигналам самоуничтожения, приобретают способность выходить из костного мозга в периферическую кровь, не дожидаясь созревания. Обнаружение филадельфийской хромосомы, гена BCR-ABL или его белкового продукта являются основными способами диагностики хронического миелолейкоза.

Наличие филадельфийской хромосомы исследуют в клетках периферической крови или костного мозга. При использовании крови её взятие производят обычным способом – посредством пункции вены и набора необходимого количества крови в вакутейнер. Взятие костного мозга  проходит под местной анестезией, поэтому, если имеется аллергия на какой-либо местный анестетик, необходимо обязательно сообщить об этом доктору. После наступления анестезии врач специальной иглой производит пункцию кости (обычно из грудины или гребней подвздошных костей), шприцем аспирирует костный мозг и перемещает его в пробирку. Несмотря на анестезию, непосредственно в момент аспирации могут возникать болевые ощущения из-за перепада давления в полости кости. После манипуляции на место пункции накладывают асептическую повязку.

Стандартным методом для обнаружения описанной хромосомной аномалии является цитогенетическое исследование клеток костного мозга, однако оно не всегда позволяет выявить филадельфийскую хромосому, и в таких случаях рекомендуется более чувствительный анализ – FISH. Флюоресцентная in-situ гибридизация является молекулярно-генетическим исследованием, которое позволяет выявить в генетическом материале анализируемых клеток последовательность нуклеотидов, характерную для химерного гена BCR-ABL. Для этого применяются специальные последовательности ДНК, аналогичные участкам нормальных генов ABL и BCR, меченные флюоресцирующими веществами разных цветов – ДНК-зонды. В процессе анализа под воздействием высокой температуры и химических веществ двухцепочечные молекулы ДНК разделяются на отдельные цепи. Следующим этапом происходит гибридизация – соединение цепочек зондов с подходящими участками на клеточной ДНК. Результат гибридизации врач оценивает с помощью флюоресцентного микроскопа, который позволяет увидеть свечение, испускаемое присоединившимися к нативной ДНК зондами. При отсутствии транслокации каждый зонд присоединится к своей хромосоме и в микроскоп будут видны два разных и удаленных друг от друга свечения. Химерный ген BCR-ABL на 22-й хромосоме присоединит к себе оба зонда, и в микроскопе свечение будет исходить из одной точки, а его цвет поменяется на соответствующий комбинации двух исходных.

Для чего используется исследование?

• Для выявления мутантного гена BCR-ABL при первичной диагностике хронического миелолейкоза, а также в процессе лабораторного мониторинга эффективности терапии и прогрессирования заболевания.

Когда назначается исследование?

При отсутствии филадельфийской хромосомы по данным стандартного цитогенетического исследования или его недоступности:

• при первичной диагностике хронического миелолейкоза;
• через 3 и 6 месяцев от начала терапии ингибитором тирозинкиназ – для оценки ответа предпочтительнее проводить молекулярное исследование (ПЦР), однако при его недоступности допускается выполнение FISH;
• через 12 месяцев от начала терапии ИТК – если по результатам ПЦР не достигнут полный цитогенетический или большой молекулярный ответ;
• всегда при неудаче лечения;
• при появлении клинических или лабораторных признаков прогрессирования заболевания.

Дифференциально-диагностические критерии уровней ответа на терапию ингибиторами тирозинкиназ, а также их интерпретация в качестве оптимального результата или неудачи лечения рассматриваются по утвержденным единым международным рекомендациям.

Что означают результаты?

Помимо исследования наличия BCR-ABL в анализируемом материале, при обнаружении химерного гена указывается, в какой доле проанализированных клеток он выявлен, исходя из чего определяется уровень достигнутого ответа (однако необходим анализ не менее 200 ядер):

• более 95% – отсутствие цитогенетического ответа;

• 65-95% – минимальный цитогенетический ответ;

• 36-65% – малый цитогенетический ответ;

• ≤ 35% – частичный цитогенетический ответ;

• 0%  – полный цитогенетический ответ.

Частичный и полный цитогенетические ответы соответствуют выраженному снижению Ph-позитивных клеток и определяются как большой цитогенетический ответ.

Что может влиять на результат?

Нарушения в проведении отдельных этапов исследования, опыт и квалификация врача молекулярно-генетической диагностики.

Важные замечания

• Последние рекомендации NCCN (National Comprehensive Cancer Network, США) допускают использование FISH в целях мониторинга ответа на терапию ингибиторами тирозинкиназ только при недоступности стандартного цитогенетического исследования или количественной полимеразной цепной реакции.
• Целесообразность выполнения данного исследования, особенно в целях мониторинга ответа на проводимую терапию ингибиторами тирозинкиназ, необходимо согласовывать с лечащим врачом-гематологом. Равно как и интерпретация полученных результатов и принятие решения о продолжении или смене таргетного препарата должны проводиться исключительно доктором.
• Если для взятия биоматериала для исследования предполагается проведение пункции костного мозга, необходимо предупредить врача о приеме каких-либо лекарств, влияющих на свертываемость крови.

Также рекомендуется

• Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с обязательной микроскопией мазка крови)

• Морфологическое исследование трепанобиоптата костного мозга

• Мочевая кислота в сыворотке

• Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) общая

Кто назначает исследование?

Гематолог, онколог, терапевт, врач общей практики.

Литература

• Wintrobe’s clinical hematology / editors, John P. Greer, Daniel A. Arber, Bertil Glader, Alan F. List, Robert T. Means Jr., Frixos Paraskevas, George M. Rodgers. – 13th edition. Lippincott Williams & Wilkins, 2014. Pages 1711–1712.

1. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: Chronic Myeloid Leukemia. Version 4.2018 – January 24, 2018. Available at www.nccn.org.

2. Гематология: национальное руководство / под ред. О. А. Рукавицына. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2015. С. 381–398.