FISH-анализ делеции ТР53 гена

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) – цитогенетический метод исследования, в процессе которого детектируется наличие и локализация специфических ДНК-последовательностей на хромосомах. Ген ТР53 является "стражем генома", в его функции входит контроль за целостностью ДНК. Если геном клетки повреждается, ТР53 запускает процессы апоптоза (саморазрушения клетки), в том числе и в кроветворной ткани. Мутации в этом гене приводят к тому, что клетка не разрушается, а продолжает функционирование с нарушенным генотипом. Исследование на наличие мутаций в гене ТР53 крайне важно для диагностики и прогнозирования течения множественной миеломы и хронического лимфолейкоза.

Преимущества исследования

• Является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций при количествах лейкозных клеток менее 10⁹, обеспечивая при этом быстрый анализ большого (> 500) числа клеток. Обладает высокой точностью для идентификации неизвестных фрагментов хромосомной ДНК.
• Исследование FISH может быть применено как к метафазным, так и к интерфазным ядрам, то есть к неделящимся клеткам.
• Позволяет определить даже самые небольшие генетические аномалии, которые нельзя рассмотреть при помощи обычного микроскопа и стандартных окрасок.

Синонимы русские

Флуоресцентная гибридизация in situ, молекулярная диагностика онкогематологических заболеваний – хронический лимфолейкоз и множественная миелома.

Синонимы английские

Fluorescent in situ hybridization, molecular diagnostics of oncohematological diseases: chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma.

Метод исследования

Флуоресцентная гибридизация in situ.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Специальной подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Анализ с помощью флюоресцентной in situ гибридизации (fluorescence in situ hybridization, FISH) – молекулярно‐цитогенетический метод для идентификации генетических аберраций (отклонений от нормы). Изначально он использовался как исследовательский для выявления наличия или отсутствия специфической ДНК-последовательности в хромосомах, но благодаря прогностической ценности был внедрен в клиническую практику.

Метод основан на использовании флуоресцентномеченых ДНК-зондов, которые представляют собой искусственно синтезированные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом. ДНК-зонды различаются по специфичности: для каждой хромосомной аномалии используются свои ДНК-зонды. Также зонды различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие – к конкретному локусу (фрагменту хромосомы или гена).

После специальной процедуры – денатурации молекула ДНК приобретает вид одноцепочечной нити. ДНК-зонд гибридизуется (связывается) с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа. Данное состояние интерпретируется как положительный результат FISH-теста. При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-зонды в ходе реакции "отмываются", что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет определить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию. Таким образом, FISH-тест – это еще и количественный метод.

FISH имеет широкие возможности в клинической онкологии для обнаружения хромосомных аномалий в опухолевых клетках. Метод позволяет исследовать генетический состав клетки как во время митоза, так и в интерфазе. Он имеет высокую чувствительность – позволяет обнаружить индивидуальные гены, кроме того, в одном препарате может быть использовано несколько зондов с различными красителями.

FISH-анализ широко применяется при лимфопролиферативных заболеваниях, являясь в ряде случаев определяющим фактором для подтверждения диагноза.

Хронический лимфолейкоз характеризуется моноклональной экспансией зрелых В-клеток и крайне гетерогенным клиническим течением, отражающим сложность геномных изменений. Мутационный статус гена-супрессора опухоли TP53 – важный пример этой сложности, поскольку он может изменяться в течение заболевания. Примечательно, что мутационный статус TP53 является как прогностическим, так и фармакопредиктивным фактором, который необходимо оценить до первого лечения и который требуется учитывать в последующем для контроля терапевтического эффекта и оценки вероятности механизмов резистентности. Поскольку изменения в гене TP53 связаны с большинством пациентов, устойчивых к химио- и иммунотерапии, приводя к более короткой выживаемости даже в эпоху новых лекарств, точный анализ мутаций TP53 и делеции соответствующего хромосомного локуса 17p13.1 (del (17p) должны учитываться при первичной диагностике еще до начала лечения. Клиническое течение хронического лимфолейкоза очень неоднородно: от стабильного в течение десятилетий до довольно быстрого прогрессирования, требующего лечения. Пациенты с генетическими аномалиями, включая цитогенетические аберрации и генные мутации (в том числе делеции гена TP53), как правило, имеют плохой прогноз.

Множественная миелома (ММ) представляет собой В‐клеточное новообразование, характеризующееся большой геномной и молекулярной сложностью, что в значительной степени объясняет вариабельность, наблюдаемую во время клинического течения и ответа на лечение. Цитогенетические аномалии остаются наиболее значимыми прогностическими факторами. Делеция хромосомы 17p (del (17p), которая содержит локус гена TP53, присутствует у 8–13 % впервые диагностированных пациентов с ММ и, вероятно, является цитогенетическим изменением, связанным с наиболее неблагоприятным прогнозом, ухудшая выживаемость. Биаллельная инактивация (инактивация обоих аллельных вариантов) гена TP53 встречается менее чем в 1 % случаев и ассоциируется с крайне неблагоприятным прогнозом.

Для чего используется исследование?

• Для уточнения диагноза при подозрении на хронический лимфолейкоз и множественную миелому.
• Для повторного консультирования при подозрении на злокачественное заболевание крови.
• Для выбора тактики лечения и оценки прогноза заболевания, которые зависят от хромосомного состава опухоли.
• Чтобы определить наличие или отсутствие конкретной хромосомной аберрации.

Когда назначается исследование?

• При подозрении на злокачественное заболевание крови для выбора тактики лечения и оценки прогноза, который зависит от хромосомного состава опухоли.
• Для подтверждения диагноза при наличии клинических предпосылок: клиническая картина заболевания, изменения гемограммы, наличие специфических синдромов.
• Для контроля "минимальной остаточной болезни" после химиотерапии или пересадки костного мозга.

Кто назначает исследование?

Гематолог, онколог.

Также рекомендуется

• Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с обязательной микроскопией мазка крови)
• Ретикулоциты
• Морфологическое исследование трепанобиоптата костного мозга
• Цитогенетический анализ клеток костного мозга (кариотип)
• FISH-анализ моносомии, делеции 13-й хромосомы–(del(13),-13)
• FISH-анализ перестроек ATM гена
• FISH-анализ перестроек IGH гена
• FISH-анализ транслокации t(11;14)(q13;q32)
• FISH-анализ транслокации t(14;16)(IGH/MAFB)
• FISH-анализ транслокации t(4;14)(p16;q32)

Литература

• Bracher S, Fuhrmann I, Jeromin S. Clonal evolution in chronic lymphocytic leukemia is associated with an unmutated IGHV status and frequently leads to a combination of loss of TP53 and TP53 mutation. Mol Biol Rep. 2022 Dec;49(12):12247-12252.
• De Luca G, Cerruti G, Lastraioli S. The spectrum of subclonal TP53 mutations in chronic lymphocytic leukemia: A next generation sequencing retrospective study. Hematol Oncol. 2022 Dec;40(5):962-975.
• Nadeu F, Delgado J, Royo C. Clinical impact of clonal and subclonal TP53, SF3B1, BIRC3, NOTCH1, and ATM mutations in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2016 Apr 28;127(17):2122-30.
• De Ramón C, Rojas EA, Cardona-Benavides IJ. Transcriptional signature of TP53 biallelic inactivation identifies a group of multiple myeloma patients without this genetic condition but with dismal outcome. Br J Haematol. 2022 Nov;199(3):344-354.