Иммуноцитохимическое исследование соскобов шейки матки с определением белка р16 и Ki 67 (включая жидкостную цитологию - окрашивание по Папаниколау)

Выявление атипичных клеток плоского эпителия шейки матки, экспрессирующих одновременно белок р16 и маркер пролиферации Ki-67, указывает на нарушение регуляции клеточного деления и обеспечивает более точную диагностику онкопатологии высокой степени тяжести. Иммуноцитохимическое исследование проводится в целях обнаружения предраковых изменений и рака шейки матки у женщин, а также позволяет дифференцировать вирусную составляющую дисплазии шейки матки.

Состав исследования

• Жидкостная цитология. Исследование соскоба шейки матки и цервикального канала (окрашивание по Папаниколау)
• Иммуноцитохимическое исследование соскобов шейки матки с определением белка р16 и Ki-67

Синонимы русские

Мазок по Папаниколау, Пап-тест, мазок на онкоцитологию, белок р16; p16^INK4a; онкопротеин.

Синонимы английские

Pap smear, Papanicolaou Smear; Cervical Smear; Cervical Oncocytology, р16 protein; p16^INK4a; oncoprotein; immunocytochemical study.

Метод исследования

Метод жидкостной цитологии + иммуноцитохимический метод.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок смешанный из цервикального канала и поверхности шейки матки.

Общая информация об исследовании

Рак шейки матки (РШМ) по распространенности занимает 3-е место среди всех злокачественных опухолей у женщин (после рака молочной железы и рака толстой кишки). Частота инвазивного рака шейки матки в мире составляет 15-25 на 100 000 женщин. Новообразования шейки матки возникают в основном у женщин среднего возраста (35-55 лет), редко диагностируются моложе 20 лет и в 20 % случаев выявляются в возрасте старше 65 лет.

5-летняя выживаемость при локализованном (местном, in situ) раке шейки матки равна 88 %, в то время как выживаемость при распространенном раке не превышает 13 %.

К факторам риска развития рака шейки матки относится инфицирование вирусом папилломы человека (онкогенные серотипы HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 45 и др.), курение, хламидийная или герпетическая инфекция, хронические воспалительные гинекологические заболевания, длительное применение противозачаточных препаратов, случаи рака шейки матки в семье, раннее начало половой жизни, частая смена половых партнеров, недостаточное поступление с пищей витаминов А и С, иммунодефициты и ВИЧ-инфекция.

Согласно международным рекомендациям, все женщины должны проходить скрининг (досимптомное обследование) на рак шейки матки через 3 года после начала половой жизни, но не позже 21 года. Начиная с 30-летнего возраста пациентки, у которых было 3 последовательных отрицательных результата при исследовании мазков из шейки матки, могут проходить скрининг каждые 2-3 года. Женщины с факторами риска (инфицирование вирусом папилломы человека, иммунодефицитные состояния) должны продолжать ежегодный скрининг. Женщины 65 лет и старше с 3 и более нормальными результатами анализа мазков из шейки матки за последние 10 лет могут не участвовать в скрининге. Переболевшим раком шейки матки, имеющим папиллома-вирусную инфекцию или ослабленную иммунную систему, желательно продолжать скрининг. Женщины, перенесшие удаление матки и шейки матки, могут не сдавать этот анализ, если операция была выполнена не из-за рака или предракового состояния шейки матки. Те, у кого операция была только на матку, без удаления шейки, должны продолжать участие в скрининге.

Жидкостная цитология  – инновационный метод цитологического исследования, идеальный для диагностирования неоплазий слизистой оболочки канала и влагалищной части маточной шейки; применяется при подозрении у пациентки на рак или дисплазию. Благодаря нему можно обнаружить рак на самых ранних стадиях развития.

После взятия мазка на онкоцитологию биоматериал помещается в жидкую среду. С помощью специальной центрифуги происходит "отмывание" клеток (цитопрепаратов), которые концентрируются в одном месте и образуют ровный слой. При этом заключение врача-цитолога будет более точным и информативным, нежели при обычной цитологии, когда материал, взятый для исследования, сразу же наносится на медицинское стекло для анализов.

Преимуществом ПАП-теста является высокая четкость изображения клеток. При использовании этой технологии полученный материал смешивается со специальным раствором, который механически отделяет клетки эпителия от загрязнений. В результате число ложно-отрицательных результатов значительно сокращается.

Цитологическое исследование материала из шейки матки и цервикального канала, окрашенного по методу Папаниколау с соблюдением методики проведения теста и условий подготовки к анализу, позволяет с высокой чувствительностью и достоверностью выявить атипичные клетки в материале, предраковые состояния (дисплазию, интраэпителиальную неоплазию шейки матки). Чаще всего исследуют биоматериал, полученный при помощи специальной цитощетки из двух точек (эпителий эндоцервикса и экзоцервикса). В мазок должен попасть материал из зоны трансформации, так как около 90 % неопластических состояний исходят из зоны стыка плоского и цилиндрического эпителия и только 10 % – из цилиндрического. При данном исследовании также могут быть выявлены признаки наличия инфекции, патологии эндоцервикса и эндометрия.

Иммуноцитохимический метод – это метод молекулярной иммунологической диагностики, позволяющий идентифицировать клеточные и тканевые молекулы-антигены в результате их связывания с антителами и формирования комплекса "антиген-антитело". Данный метод позволяет проводить иммунологический анализ цитологического материала в условиях сохранения морфологии клеток.

В современной диагностике рака шейки матки иммуноцитохимическое исследование позволяет выявлять белок р16 (p16^INK4a), а точнее его экспрессию на поверхности эпителиальных клеток. Исследованию могут быть подвергнуты отдельные мазки из шеечного канала (эндоцервикса) или с наружной поверхности шейки матки (экзоцервикса) или смешанный мазок, полученный при нанесении на одно предметное стекло биоматериала из эндоцервикса и экзоцервикса.

Белок р16 – это клеточный протеин, участвующий в регуляции клеточного цикла и являющийся ингибитором активности циклинзависимой киназы CDK4/6. В норме киназа неактивна и клеточная пролиферация инактивирована за счет наличия прочной связи фактора транскрипции E2F с белком-супрессором рRb. Белок р16 осуществляет контроль разобщения комплекса E2F-Rb, не допуская пролиферации клетки. В нормально функционирующих клетках синтез р16 сдерживается по механизму обратной связи и, следовательно, концентрация данного белка в нормальной клетке чрезвычайно мала, что проявляется негативной иммуноцитохимической реакцией. Онкобелок Е7 ВПЧ с высоким онкогенным риском посредством внутриклеточных механизмов приводит к разобщению комплекса E2F-рRb, активации CDK4/6 киназы, а впоследствии стимулирует чрезмерную клеточную пролиферацию. При этом повышается экспрессия белка р16, что проявляется положительной иммуноцитохимической реакцией мазков клеток.

Иммуноцитохимическое исследование онкобелка р16 позволяет достоверно дифференцировать опухолевую и неопухолевую дисплазии, а также обладает высокой диагностической чувствительностью. Известно, что экспрессия данного белка связана со слабовыраженной (CINI), умеренной (CINII) и резковыраженной дисплазией (CINIII) и внутриэпителиальным раком шейки матки. Он практически не обнаруживается в клетках плоского эпителия без признаков дисплазии (0-2 % случаев).

Таким образом, выявление экспрессии белка р16^INK4a иммуноцитохимическим методом в дополнение к рутинному методу жидкостной цитологии и окраски мазков по Папаниколау позволяет повысить чувствительность теста, выявлять персистирующую папиллома-вирусную инфекцию до появления морфологических изменений, с наибольшей точностью обнаружить риск развития рака шейки матки, своевременно поставить диагноз и назначить требуемое лечение.

Ki-67 – антиген раковой опухоли, который можно обнаружить в клетке, когда она делится, но в фазе покоя клеточного цикла он не определяется. Эта особенность Ki-67-маркера служит полезным индикатором прогноза поведения злокачественной опухоли. Тест проводится на образце ткани, полученном из опухоли в результате биопсии или оперативным путем. Тест Ki-67 не является специфичным для рака молочной железы, он применяется и при других злокачественных заболеваниях. Но большая доля исследований по определению его значения как маркера опухоли приходится на этот вид рака. Высокие уровни Ki-67 указывают на агрессивность опухоли и неблагоприятный прогноз.

Скрининг и ранняя диагностика предраковых состояний и начальных стадий рака шейки матки позволяют своевременно провести эффективное лечение и предотвратить опасные последствия.

Для чего используется исследование?

• Скрининг и диагностика предраковых заболеваний шейки матки.
• Скрининг и диагностика рака шейки матки, цервикальной интраэпителиальной неоплазии, наблюдение женщин после лечения этих заболеваний.

Когда назначается исследование?

• При периодическом обследовании девушек и женщин через 3 года после начала половой жизни, но не позже 21 года (рекомендовано брать анализ ежегодно и не реже чем каждые 3 года).
• Каждые 2-3 года начиная с 30-летнего возраста и до 65 лет при трех последовательных отрицательных результатах.
• Ежегодно при наличии вируса папилломы человека (ВПЧ), при иммунной системе, ослабленной в результате трансплантации, химиотерапии или длительного применения стероидных гормонов.
• Каждые 6 месяцев первые два года после лечения рака шейки матки или цервикальной интраэпителиальной неоплазии.
• При обследовании женщин с высоким риском онкологических заболеваний, наличием рака шейки матки у родственников, с хроническими воспалительными и инфекционными гинекологическими заболеваниями.

Что означают результаты?

Жидкостная цитология. Исследование соскоба шейки матки и цервикального канала (окрашивание по Папаниколау)

С учетом классификации по системе Бетесда "The 2001 Bethesda System terminology"

1. Количество материала

• Материал полноценный (адекватный) – полноценным материалом считается мазок хорошего качества, содержащий достаточное количество соответствующих типов клеток.
• Материал недостаточно полноценный (недостаточно адекватный) – в материале отсутствуют клетки эндоцервикса и/или метаплазированные клетки, клетки плоского эпителия находятся в достаточном количестве, или клеточный состав скудный.
• Материал неполноценный (неадекватный) – по материалу невозможно судить о наличии или отсутствии патологических изменений шейки матки.

2. Интерпретация результатов:

• Отрицательный Пап-тест – эпителиальные клетки в пределах нормы, цитограмма соответствует возрасту, норме.
• Доброкачественные изменения – присутствие неопухолевых клеток, признаки воспаления (увеличенное количество лейкоцитов), инфекции (значительное количество кокков, палочек). Возможно обнаружение инфекционных агентов (с указанием возбудителя), например трихомонад, дрожжей.
• Изменения клеток плоского эпителия (требуют повышенного внимания, дообследования и при выявлении предрака или рака лечения):

• атипичные клетки плоского эпителия неясного значения;
• атипичные клетки плоского эпителия, не позволяющие исключить HSIL;
• плоскоклеточное интраэпителиальное поражение;
• низкая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения;
• высокая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения;
• цервикальная интраэпителиальная неоплазия 1-й, 2-й или 3-й степени;
• карцинома in situ;
• плоскоклеточный рак – инвазивный рак.

• Изменения железистых клеток (требуют повышенного внимания, дообследования и при выявлении предрака или рака лечения):

• атипичные железистые клетки;
• атипичные железистые клетки, похожие на неопластичные;
• аденокарцинома.

При выявлении минимальных изменений или атипичных клеток неясного значения рекомендовано провести обследование на онкогенные серотипы вируса папилломы человека.

Иммуноцитохимическое исследование соскобов шейки матки с определением белка р16 и Ki-67

Выявление изменений

• Плоскоклеточное интраэпителиальное поражение низкой степени тяжести – воспалительные изменения, характерные для инфекции ВПЧ, слабая дисплазия эпителия (CINI);
• Плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени тяжести – умеренная дисплазия эпителия (CINII);
• Тяжелая дисплазия эпителия и внутриэпителиальный рак шейки матки (CINIII).

Отсутствие изменений

• Отсутствие плоскоклеточных интраэпителиальных поражений, тяжелой дисплазии и плоскоклеточного рака шейки матки – иммуноцитохимическая реакция отрицательная.

Что может влиять на результат?

У девушек моложе 20 лет возможны ложноположительные результаты в связи с наличием изменений эпителия на фоне транзиторных гормональных нарушений.

Важные замечания

• При острой инфекции желательно получать материал в целях обследования и выявления этиологического агента; после лечения, но не ранее чем через 2 месяца, необходим цитологический контроль.
• Существует вероятность отрицательного результата анализа при изменениях эпителия в шейке матки, поэтому важно регулярно проходить повторные обследования и при некорректном взятии материала повторить тест.

Также рекомендуется

• Цитологическое исследование мазков (соскобов) с поверхности шейки матки (наружного маточного зева) и цервикального канала на атипию
• Антиген плоскоклеточной карциномы (SCCA)
• Human Papillomavirus высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы), ДНК без определения типа [ПЦР] (мазок урогенитальный, ректальный мазок, биоптат)

Кто назначает исследование?

Гинеколог, онколог.

Литература

• Apgar BS, Zoschnick L, Wright TC (November 2003). "The 2001 Bethesda System terminology". Am Fam Physician 68 (10): 1992-8.PMID 14655809.
• Arbyn M. et al. (2010). "European Guidelines for Quality Assurance in Cervical Cancer Screening. Second Edition – Summary Document". Annals of Oncology 21 (3): 448 – 458.
• American College of Obstetricians and Gynecologists, "ACOG Committee Opinion No. 483: Primary and Preventive Care: Periodic Assessments," 2011, Obstet Gynecol, 2011, 117(4):1008-15.PubMed 21422880.